文章插图
Realtime PCR【Realtime PCR】所谓Real-Time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入萤光基团，利用萤光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标準曲线对未知模板进行定量分析的方法 。利用萤光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标準曲线的分析对起始模板进行定量分析 。real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重複性 。该技术已经被广泛用于监测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因晶片，siRNA干扰的实验结果 。
基本介绍中文名：实时萤光定量PCR
外文名：Realtime PCR
操作流程1：收集样品
操作流程2：总RNA提取
操作流程3：cDNA合成
操作流程1 收集样品
文章插图
2 相关试剂 总RNA提取试剂TREzol Reagent (RNA提取试剂), M-MLV（cDNA逆转录酶）, RNA 纯化试剂, RealqPCR MasterMix （萤光定量PCR预混试剂） 。3 实验仪器 萤光定量PCR仪; PCR仪；低温离心机 。4 总RNA提取5 cDNA合成 在0.5ml的离心管中加入1µl模板总RNA（1µg/µl）； 2µl随机引物（T18, 10pmol/ul）；2µl 10mM dNTP mix；加水至15µl体系 。混匀后70℃变性RNA 5分钟，冰上速冷1分钟，离心将溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer；1µl RNaseout；1µl M-MLV RT；加水至30µl体系 。PCR仪中反应条件设定 37℃延伸60min，70℃保温15min终止反应 。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存备用 。6 引物设计与合成
文章插图
thermal cycler protocol引物需要管家基因引物与目标基因引物 。7 实时定量PCR按以下反应体系进行: 2x RealqPCR MasterMix（Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP）25ul；上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul；cDNA template 2ul 。定量PCR仪扩增反应条件设定：50 ℃ 2min ；95 ℃ 10min ；95℃ 15s --60 ℃ 60 s （40个循环） 。8 PCR产物溶解曲线分析将所扩增的PCR 产物进行溶解曲线分析，单峰溶解曲线表示扩增产物单一，无非特异性扩增产物 。溶解曲线生成的反应程式为: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s 。9 数据分析软体对数据进行处理分析 。主要套用1. DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等；2. 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 晶片或差显结果的确证；3. 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等 。常用方法Realtime PCR 常用的两种方法分别为Sybr green（萤光染料掺入法）和Taqman probe （探针法） 。萤光染料掺入法:在PCR反应体系中，加入过量SYBR萤光染料，SYBR萤光染料特异性地掺入DNA双链后，发射萤光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何萤光信号，从而保证萤光信号的增加与PCR产物的增加完全同步 。此方法适用于：1、灵敏度高：使用SYBR可使萤光效果增强到1000倍以上2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉 。3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用 。4、高通量大规模的定量PCR检测5、专一性要求不高的定量PCR检测 。探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团 。探针完整时，报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离，从而萤光监测系统可接收到萤光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个萤光分子形成，实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步此方法适用于：1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重複性好，特异性更高 。2、适用于扩增序列专一的体系的检测 。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测 。4、靶基因的特异序列较短，无论怎样最佳化引物设计条件都不能解决 。5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量 。6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定 。