一抗孵育时间,不能超过多久 一抗孵育时间长了

一抗孵育时间,不能超过多久 一抗孵育时间长了


回答一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关 。一般情况下,在37℃的条件下 , 孵育1-2小时左右 。在室温的条件下,孵育3小时左右 。在4℃的条件下,孵育18-24小时左右 。如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长,会导致非特异性吸附,增加洗涤的难度,最终因洗涤不彻底而出现非特性显色 。

一、一抗孵育时间,不能超过多久
1、一抗的定义
一抗指的是能够和非抗体性抗原(特异性抗原)特异性结合的蛋白,也就是平常所说的抗体 。二抗指的是能和抗体结合的抗体,主要用于检测抗体的存在 , 放大一抗的信号 。
2、一抗的孵育时间
(1)一抗的孵育时间与温度,抗体浓度有关 。一般情况下,在37℃的条件下 , 孵育1-2小时左右 。在室温的条件下,孵育3小时左右 。在4℃的条件下,孵育18-24小时左右 。

(2)如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长,会导致非特异性吸附,增加洗涤的难度 , 最终因洗涤不彻底而出现非特性显色 。
二、双抗体夹心法检测未知抗原
1、包被
用0.05M碳酸盐包被缓冲液(ph9.6)对抗体进行稀释,直至蛋白质含量为1-10μg/ml为止 。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜 。第二天的时候,去掉孔内溶液,然后用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟 。

2、加样
【一抗孵育时间,不能超过多久 一抗孵育时间长了】将0.1ml经过稀释的待检样品放到反应孔中,在37℃的环境条件下孵育1小时 , 然后进行洗涤 。
3、加酶标抗体
在各个反应孔中,加入0.1ml新鲜稀释的酶标抗体,在37℃的环境条件下,孵育0.5-1小时 , 然后进行洗涤 。
4、加底物液显色
在各个反应孔中 , 加入0.1mlTMB底物溶液(应当临时配制),37℃的环境条件下10-30分钟 。
5、终止反应
在各个反应孔孔中,加入0.05ml的2M硫酸 。
6、结果测试
(1)在白色背景下,用肉眼进行观察即可 。反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅 。
(2)在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,如果大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性 。