Cell HostMicrobe | 两株益生菌或能替代抗生素预防仔猪早期断奶腹( 二 ) _仔猪

H,I图分别代表了腹泻发生率和腹泻指标
Mix表示：五菌混合物[包括 L.LA39, L. , B. , E. , and B. ]; LG表示：L.LA39; LF表示：
L. ; BP表示：B. ; EH表示：E. ; BH表示：B. ).
转移五细菌联合体或单独灌喂L.LA39 或 L. ，可显著降低早期断奶 LY 仔猪的腹泻发生率和指标(单独的LG,LF两种菌或者五种菌的混合与对照有显著差异,但是其余三种菌的单独品与对照无显著差异,确定起作用的是LG和LF两种菌) 。
4.肠道微生物介导的腹泻抵抗依赖于分泌型 A
L.LA39分泌环状 A细菌素, 假设L.LA39 介导的腹泻抗性可能来源于 A细菌素对肠上皮的作用。实验结果发现LY（低剂量）仔猪和 CM 仔猪的粪便细菌A 编码基因 (gaaA) 丰度显著高于 LY（盐水）仔猪和 LY 仔猪.
五菌联合体 (Mix) 组和L.LA39 组的粪便细菌 gaaA 基因丰度均显著高于对照组和 PBS 组, 提示分泌型 A 可能促进早期断奶仔猪的抗腹泻作用。且敲除 gaaA 基因（图 3c 和 3D）阻断了L.LA39 介导的腹泻抗性（图 3E 和 3F）和粪便细菌 gaaA 基因丰度的增加（图 3G），表明 A 对腹泻抗性至关重要。粪便L. LA39在野生型组和 gaaA 基因敲除 (6gaaA) 组之间的相对丰度无显著差异，（图 3H），表明敲除 gaaA 基因并没有改变仔猪粪便微生物群中的L.LA39的相对丰度。L. 也编码 gaaA 基因和分泌的A（图 3i 和 3j）。这些发现揭示了早期断奶仔猪中由L. LA39 和 L. 介导的腹泻抗性依赖于分泌型 A 。
5.与肠上皮细胞中的细胞质膜结合的A 增强肠液吸收并减少肠液分泌
免疫荧光染色结果表明，断乳仔猪空肠上皮细胞中， A 与细胞质膜结合（图4A）。重组纯化的 His- A 在来自空肠 (IPEC-J2) 的培养的肠猪上皮细胞系中结合到细胞质膜上（图 4B），表明A 在体内和体外与细胞质膜结合。
在 IPEC-J2 细胞中，His- A 显著增加了与肠道吸收相关的蛋白（NHE3、、DRA 和 PAT1）的表达，降低了与肠道分泌相关的蛋白（NKCC1、CFTR 和 CaCC1）的表达。（图 4C 和 4D），提示A 具有重要的抗腹泻作用。
越来越多的证据表明，细胞第二信使，包括 Ca2+ 和环核苷酸，如环磷酸腺苷 (cAMP) 和环磷酸鸟苷 (cGMP)，有助于减少肠上皮液体吸收和增强肠液分泌，从而促进腹泻。结果表明，用 His- A 处理细胞后， Ca2+ 水平没有明显变化（图 4E 和 4F），而用 His- A 处理后环核苷酸（cAMP 和 cGMP）水平明显降低。（图E-J）
6. A 通过 KRT19 与细胞质膜结合对A 介导的肠液吸收增强和肠液分泌减少至关重要
使用 His 标记的A 和未标记的A 作为诱饵来寻找它们的相互作用蛋白，进行免疫沉淀实验。发现 IPEC-J2 细胞中的角蛋白 18(KRT18) 或角蛋白 19(KRT19) 蛋白可能与his标签 A和 A 相互作用（图 5A）
免疫共沉淀 (coIP) 实验证实， A 与 KRT19（一种位于细胞质膜和细胞质中的蛋白）相互作用，但不与 KRT18 。

文章插图
敲除 KRT19 和用 KRT19 抗体处理都阻断了A 与质膜的结合。KRT19 的敲除也阻断了 A介导的环核苷酸（cAMP 和 cGMP）水平的降低（图 5E 和 5F），肠液吸收增强和肠液分泌减少（图 5G 和 5H）.
7. A通过激活由机制靶点介导的磷酸二酯酶活性，降低细胞环核苷酸水平，增加肠液吸收和减少肠液分泌.
接下来研究了在肠上皮细胞的细胞质膜中A 与 KRT19 结合介导的改变的肠道肠液吸收和肠液分泌的机制。
在 IPEC-J2 细胞中，环化酶（鸟氨酸环化酶、腺苷转化酶）活性没有显著改变（图 6A-6D），而 PDE（环核苷酸）活性显著增加（图 6E-6H）。
异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)是一种 PDE 活性抑制剂（图 6I 和 6J），可逆转 A 介导的环核苷酸水平降低（图 6K 和 6L），增强肠道吸收，减少 IPEC-J2 细胞的肠道分泌（图 6M 和 6N）。